Методы выделения антибиотиков

ВВЕДЕНИЕ

Для идентификации антибиотиков и их отнесения к той или иной группе антибактериальных препаратов служит ряд хроматографических методов. До недавнего времени наиболее распространенным методом была бумажная хроматография (восходящая, нисходящая, круговая, центрифужная, одно- и двумерная бумажная хроматография, хроматография на бумаге, пропитанной буферами, на ионообменной бумаге и т. п.), однако впоследствии широкое распространение получила также ТСХ (преимущественно на силикагеле или на оксиде алюминия), отличающаяся простотой аппаратурного оформления и высокой скоростью анализа . Чтобы придать сорбенту определенные свойства, его можно предварительно обработать соответствующим реагентом. Например, для разделения тетрациклинов, способных образовывать хелаты, Нишимото и др. использовали пластинки с силикагелем, пропитанным раствором динатриевой соли ЭДТА. Известны примеры хроматографическогоанализа антибиотиков на пластинках с целлюлозой, сефадексом и активным углем.

Для идентификации многих антибиотиков можно использовать также электрофорез и противоточное распределение. Что же касается разделения и идентификации антибиотиков с помощью ГЖХ то в последние годы этот метод в значительной степени заменен на ВЭЖХ, основные преимущества которой заключаются в том, что она обеспечивает высокую скорость и эффективность разделения и детектирование элюата не сопряжено с разрушением компонентов анализируемой смеси. Вместе с тем ВЭЖХ не лишена и некоторых недостатков: во-первых, при переходе от одного антибиотика к другому часто бывает необходимо менять систему растворителей и режим детектирования, и, во-вторых, ВЭЖХ в отличие от бумажной и тонкослойной хроматографии не позволяет одновременно анализировать несколько смесей.

Лишь для небольшого числа из тысяч известных антибиотиков разработаны системы классификации и идентификации. В работе на основании данных ТСХ и биоавтографии предложена классификация 151 антибиотика, обладающего противоопухолевой активностью; в работах для классификации 91 антибиотика использован метод «мгновенной ТСХ», а в работе рассмотрены вопросы, связанные с применением ТСХ-систем для классификации и идентификации антибиотиков. Существуют два справочника по хроматографии антибиотиков. В «Руководстве по хроматографии» приведены таблицы с данными по хроматографическим свойствам этих соединений. Описание ТСХ-методик можно найти в подробном обзоре Лотта и др.

Методы обнаружения антибиотиков на протяжении ряда лет практически не претерпели никаких изменений. Обычно они включают биоавтографию с помощью чувствительных к данному антибиотику микроорганизмов, посеянных на агаре, или проявление хроматограмм путем их опрыскивания растворами соответствующих реагентов с последующим просмотром при УФ-освещении. Для обнаружения антибиотиков наиболее пригоден метод биоавтографии, суть которого заключается в следующем. Высушенную бумажную хроматограмму, тонкослойную пластинпластинку или электрофореграмму прижимают к поверхности агара, содержащего культуру подходящего микроорганизма, и выдерживают в течение определенного времени. За время инкубации число бактерий увеличивается лишь в тех участках агара, которые не соприкасались с антибиотиком. По положению зон, в которых подавляется рост бактерий, определяют значения Rf соединений, проявляющих свойства антибиотика. Мейерс и Чанг предложили способ увеличения чувствительности обнаружения антибиотиков с помощью Trichomonas, основанный на использовании монофосфата фенолфталеина.

В этой курсовой работе мы не будем углубляться в вопросы, касающиеся препаративной хроматографии, а ограничимся лишь описанием методологии идентификации антибиотиков.

МЕТАБОЛИТЫ АКТИНОМИЦЕТОВ

Метод ТСХ применяли для выделения, очистки и идентификации различных продуктов метаболизма актиномицетов. Бек и др. приводят величины Rf для нонактина и некоторых его гомологов, полученные на силикагеле G со смесью хлороформ—этилацетат (1:2): нонактин 0,62, монактин 0,48, динактин 0,32 и тринактин 0,15. Бикель и др. установили значения Rf акумицина и ряда стандартных антибиотиков в трех различных растворителях на силикагеле G (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Величины Rf X 100 акумицина и стандартных антибиотиков группы макролидов, полученные на силикагеле G

Обнаружение пятен они проводили обработкой серной кислотой или методом биоавтографии. С этой целью на поверхность заряженного бактериями слоя агарового студня помещали слои фильтровальной бумаги, после чего к бумаге прижимали в течение примерно 20 мин пластинку размером 20X20 см с усилием около 2 кг. Слой агара инкубировали от 16 до 18 ч при 37 °С.

Кассани и др. описали хроматографический а