А.А. Присный, Е.А. Гребцова
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Введение
Гемолимфа беспозвоночных животных обладает всеми необходимыми функциями, несмотря на простоту организации, и отражает физиологическое состояние животного, а так же эволюционную ступень развития. Разнообразные виды воздействий влияют на насекомых на физиологическом уровне и обусловливают их жизнеспособность. В настоящее время не существует конкретных критериев оценки физиологического состояния насекомых. Возможно изучение влияния стрессоров и их идентификация по морфологическим особенностям, которые иногда являются противоречивыми и обманчивыми. Зачастую невозможно определить, какой именно из множества факторов оказал то или иное воздействие. Чтобы развиваться в этом направлении, у исследователей должна быть точная информация о физиологически и биохимически активных и чувствительных компонентах организма насекомых [1].
Наука о гемоцитах обширна и остается неизменно актуальной. Возможность выделять и идентифицировать гемоциты важна для исследований клеточного иммунитета насекомых. Гемоциты, необходимый компонент иммунной системы насекомого, выполняют ряд функций, такие как коагуляция, фагоцитоз и инкапсуляция; синтез и транспорт питательных веществ и гормонов для заживления ран посредством формирования соединительной ткани. Воздействия разнообразных стрессоров на клетки и состояние здоровья насекомых, их практическое и биомедицинское прикладное применения не достаточно изучены [2].
Доступна весьма скудная информация о типах гемоцитов насекомых, включая многочисленные виды экономической важности. Ключевой проблемой является небольшой размер многих насекомых, что делает сбор и идентификацию комплекса гемоцитов практически невозможной. Названия типов гемоцитов, которые им дают, иногда отличаются между таксонами, таким образом, что системы классификации и используемые критерии для идентификации гемоцитов в одной группе насекомых, могут полностью не соответствовать другой [3].
Авторами ранее проведены исследования и опубликованы данные о морфометрических показателях и типологии гемоцитов различных представителей класса Насекомые [4-5]- Однако информации о мембранных реакциях этих клеток на различные условия среды в доступной литературе не обнаружено.
В связи с вышесказанным целью данной работы является изучение влияния гипоосмо- тической нагрузки на объем клеток и определение мембранного резерва гемоцитов некоторых представителей отряда Dictyoptera.
Объекты и методы исследования
Исследования проведены в течение 2011-2013 годов на базе кафедры анатомии и физиологии живых организмов ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». В экспериментах использованы представители отряда Dictyoptera: Periplaneta americana, Shelfordella tartara, Gromphadorhina portentosa, Blaberus craniifer, Nauphoeta cinerea. Животных содержали в оборудованных укрытиями садках с кокосовым и опилочным грунтом. Для успешного разведения тараканов поддерживали высокий уровень влажности. Кормление проводили 2 раза в неделю.
Гемолимфу получали по стандартной методике [6]. Были проведены исследования с применением световой и зондовой микроскопии (Nikon Eclipse Ti-E, Интегра Вита NT-MDT).
Препараты фотографировали, по снимкам проводили измерения клеток, ядер, гранул и включений по длинной и короткой осям с помощью анализатора изображений «ВидеоТест» (ООО «Микроскоп Сервис», г. Санкт-Петербург).
Определяли величину мембранного резерва и изучали влияние гипоосмотической нагрузки на объем гемоцитов. Полученную гемолимфу делили на три части, каждую из которых помещали в отдельную чашку Петри. К каждой части гемолимфы добавляли 10 мкл раствора NaCl определенной концентрации (изотонический раствор - 0.97% NaCl, сильногипотонический - 0.24% NaCl) для определения мембранного резерва.
Инкубацию проводили в течение 1 минуты. Далее изучали прижизненные особенности клеток, их морфометрические показатели с помощью оптического инвертированного микроскопа Nikon Digital Eclipse Ti-E. Получали фотографии в режиме реального времени и проводили линейные измерения, применяя анализатор изображений «Видео-Тест».
Гемоциты имеют относительно эллипсоидную форму, поэтому измеряли большую, среднюю и малую ось. Используя значения этих линейных размеров, рассчитывали площадь поверхности клеток и их объём.
Формулы для расчёта показателей:
s = 4п[(арЬр+арср+Ьрср)/3]р V=4/3(nabc),
где S - площадь поверхности гемоцита, V - объём, а - большая полуось, b - малая полуось, с - средняя полуось, p=1,6075 - коэффициент К. Томсена.
Рассчитывали абсолютную величину мембранного резерва как разность между площадью поверхности клетки в сильно гипотоническом растворе и площадью поверхности клетки в изотонической среде.
AS=S(CT)-S(^,
где AS - резерв плазматической мембраны (дш2); S(CT') - площадь поверхности клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (дш 2); S^) - площадь поверхности клетки , после инкубации в изотонической среде (дш 2).
Для определения доли используемого мембранного резерва (MR) использовали следующую формулу:
(AS/ S(CT))-100 %,
где AS - резерв плазматической мембраны (дш2); S
Одними из наиболее популярных услуг на рынке IT-технологий являются создание и продвижение лендингов. Они способны положительно влиять на деятельность любого бизнес-проекта в интернете. Судя по многочисленным отзывам, заказавшие создание лендингов люди ни разу не пожалели о потраченных деньгах. Они вложили в будущее, которое неразрывно связано с интернетом. Всё больше и больше предпринимателей обращаются к услугам разных агентств, веб-студий, чтобы заказать создание лендинга у профессионалов.