Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии

Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии

Тема: Биотехнология Дата: 24.5.06

К числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, ДНК-метилтрансферазы, эндонуклеазы рестрикции, ферменты репарации, ДНК-лигазы и т.д.

Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена.

К числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, обеспечивающие воспроизведение молекул нуклеиновых кислот в клетке; ДНК-метилтрансферазы, ответственные за присоединение к ДНК метильных групп; эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов в ДНК и разрезать ДНК в определенных местах; ферменты репарации, исправляющие ошибки (мутации) в ДНК, ДНК-лигазы, сшивающие нити ДНК и т.д.

Из большого арсенала методов анализа ДНК полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на циклической репликации матрицы (реакцию проводят, циклически поднимая и понижая температуру, обычно в пределах от 40–55 до 95°C), наиболее широко применяется в генно-инженерной практике и клинической диагностике. В основе современной методологии ПЦР лежит использование термостабильной ДНК-полимеразы из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-ДНК-полимеразы). Температурный оптимум ферментативной активности Taq-ДНК-полимеразы составляет 70–72°С, фермент сохраняет активность и при 95°C. Taq-ДНК-полимераза состоит из двух глобулярных пространственно разделенных доменов: полимеризационного, осуществляющего встраивание нуклеотидов в растущую цепь ДНК, и домена, обладающего 5’–3’-экзонуклеазной активностью. Благодаря 5’–3’-экзонуклеазной активности Taq-ДНК-полимераза расщепляет небольшие фрагменты ДНК, присоединенные к цепи ДНК, которая используется в качестве матрицы при полимеризации. Такое свойство фермента нашло применение в количественных методиках ПЦР для разрушения флуоресцентных зондов.

Однако с точки зрения современных требований, предъявляемых к полимеразам, Taq-ДНК-полимераза обладает рядом недостатков. Фермент допускает ошибки при полимеризации ДНК, не способен к синтезу достаточно протяженных фрагментов НК, не обладает корректирующей (3’–5’-экзонуклеазной) активностью, недостаточно термостабилен, имеет невысокую скорость полимеризации и процессивность. 5’–3’-экзонуклеазная активность Taq-ДНК-полимеразы не удовлетворяет требованиям современных методов анализа ДНК. Нативный фермент не может использовать РНК в качестве матрицы.

Ряд отмеченных проблем можно снять, применяя в ПЦР ДНК-полимеразы из гипертермофильных архейных микроорганизмов, способных существовать при температурах, близких к температуре кипения. Например, фермент из микроорганизма Pyrococcus furiosus обладает более высокой термостабильностью и точностью при синтезе ДНК, способен обеспечивать синтез протяженных фрагментов НК. Такие свойства фермента являются следствием наличия у него 3’–5’-корректирующей нуклеазной активности. Среди недостатков Pfu-ДНК-полимеразы следует отметить относительно низкую эффективность полимеризации, более низкую по сравнению с Taq-ДНК-полимеразой скорость полимеризации, отсутствие способности к синтезу ДНК на матрице РНК.

Таким образом, фермент со свойствами, оптимальными для ПЦР, в природе пока не обнаружен. Создание эффективной ДНК/РНК полимеразы – актуальная задача сегодняшнего дня.

Создание эффективной ДНК/РНК полимеразы

Ученые из лаборатории генетической регуляции биохимических процессов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством кандидата биологических наук Владимира Лунина имеют существенный опыт в области создания продуцентов ферментов для молекулярной биологии и генетической инженерии. Группой исследователей проклонированы гены и созданы эффективные продуценты следующих ферментов нуклеотидного обмена: Thermus aquaticus ДНК полимеразы, Thermus thermophilus ДНК полимеразы/ревертазы, Klenow фрагмента ДНК полимеразы I E. coli, M-MLV ревертазы (Moloney), Thermus thermophilus неорганической пирофосфатазы (PPi), Thermus thermophilus ДНК лигазы, E. coli ДНК-лигазы, T4 ДНК-лигазы, Thermus thermophilus РНКазы H, E. coli РНКазы H, T4-полинуклеотид киназы, урацил-ДНК-гликозилазы E. сoli (UDG), Thermus aquaticus структуроспецифической эндонуклеазы (5’–3’-экзонуклеазы).

С помощью методов генной и белковой инженерии ученые получили модифицированные производные и разработали технологии получения полимераз второго поколения: Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. сoli, Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. coli и Homo sapiens, химически модифицированной Taq-ДНК-полимеразы (Thermostar ДНК полимеразы) со встроенным «горячим стартом», Taq-ДНК-полимеразы в комплексе с моноклональными антителами, также обеспечивающими «горячий старт», генетически модифицированной Taq -ДНК-полимеразы для секвенирования ДНК.

Препараты ферментов имеют низкую себестоимость и ориентированы на массовое применение. По своим качественным характеристикам они соответствуют мировому уровню и широко используются в генно-инженерной и молекулярно-биологической практике в России.

Из оригинальных ферментов и реагентов для генетической инженерии учеными лаборатории проклонированы гены и созданы следующие препараты: ДНК-полимераза из Archaeoglobus fulgidus – гипертермофильного архейного микроорганизма (данный фермент лишь на 37% гомологичен Pfu-ДНК