Механізми інактивації потенціал-залежних К+ каналів

МЕХАНІЗМИ ІНАКТИВАЦІЇ ПОТЕНЦІАЛ-ЗАЛЕЖНИХ К⁺ КАНАЛІВ

Вступ.

При деполяризації мембрани багато потенціал-залежних йонних каналів, особливо деякі К⁺ канали переходять в довготривалий стан непровідності, чи інактивації. В результаті цього істотно змінюється транзієнтна проникність мембрани для калію, не зважаючи на тривалу і сильну деполяризацію. Така властивість деяких К⁺ каналів дозволяє дуже тонко регулювати палітру активності збудливих клітин через різну частоту потенціалів дії. Тому, вочевидь, дуже важливо для біологів та біомембранологів розуміти молекулярні механізми, які викликають інактивацію К⁺ каналів та можливі способи фізіологічної регуляції цього процесу.

Інактивація К ⁺ каналів

На відміну від гомогенної інактиваційної поведінки потенціал-залежних Na⁺ каналів, потенціал-залежні К⁺ канали, досліджені в їхньому природному середовищі, показують широку різноманітність інактиваційних часових інтервалів. Інактивація цих каналів спостерігається в діапазоні від кількох мілісекунд – швидка інактивація (як у А-струму, описаного в нейронах молюсків) до майже помітного процесу тривалістю кілька тисяч мілісекунд, (як у випадку струму затриманого випрямлення в гігантському аксоні кальмара). Така різноманітність також спостерігається в дослідах з клонованими К⁺ каналами, експресованими в гетерогенному середовищі. Наприклад, ShakerB канал інактивується з часовою константою 1-3 мс, тоді як відповідний канал drk1 демонструє значно повільнішу інактивацію. Так само, К⁺ канали, клоновані з мозку ссавців, показують дуже відмінні інактиваційні інтервали. В деяких випадках неструктурні білки, що утворюють minК⁺ канали (мал.1) не піддаються інактивації навіть після деполяризаційних імпульсів тривалістю кілька секунд. Ця різноманітність інактиваційних інтервалів навіть між дуже близькими між собою продуктами генів допомогла краще зрозуміти механізми інактивації К⁺ каналів.

NH ₂ – кінцевий домен як інактиваційної частинки.

Відомо, що Shaker канали - це родина різних, але близько споріднених білків, які кодуються транскриптами альтернативного сплайсингу. Існує 5 альтернативно сплайсованих NH₂ – кінцевих варіантів Shaker і 2 СООН – кінцевих. Після того, як вдалося встановити продукт Shaker локусу дрозофіли, дослідники припустили, що альтернативні транскрипти одного й того ж самого локусу індукують експресію К⁺ каналів з різною інактиваційною поведінкою.

Таким чином, наприклад, струм через Shaker А2 – канал, який відрізняється від ShakerD 2 лише своїм NH₂ – кінцевим доменом, на 90% інактивується протягом кількох мілісекунд, тоді як струм через ShakerD 2 канал інактивується лише на 15% і значно повільніше.

IversonandRudy створювали конструкції з різними комбінаціямиNH₂ – та СООН – кінцевих варіантів Shaker і помітили виникнення як інактиваційних, так і неінактиваційних струмів після їхньої експресії. Помічена різниця може бути віднесена на рахунок присутності саме NH₂ – кінцевих доменів в кожній конструкції. Ці результати дозволили твердити про те, що структури, розташовані на NH₂ – кінці (можливо це цитоплазматичні домени) можуть бути задіяні в інактиваційному процесі.

Працюючи з Shaker В каналами Hoshiта ін. простежили, що обробка трипсином внутрішнього боку збудливої мембрани катастрофічно сповільнює інактивацію ізольованих каналів, не впливаючи на процеси активації та проникності. Ці дані узгоджуються з припущенням про участь цитоплазматичного домену в процесі інактивації і через це вчені зосередили свою увагу на аналізі амінокислотної послідовності кінцевого NH₂ домену Shaker В білку. Hoshiта співробітники робили систематичні делеції амінокислот і встановили, що делеції, які включають перші 22 амінокислоти змінюють швидкий інактиваційний процес на зразок як це робить трипсин. Такі делеції збільшують середній час, протягом якого канали перебувають у відкритому стані, збільшують кількість відкритих протягом серії каналів та зменшують тривалість інтервалів між серіями. Ці дані відповідають результатам про сповільнення інактивації макроскопічних струмів. Делеції поза ділянкою перших 22 амінокислот не порушують інактивацію, але зменшують середню тривалість відкритості каналів пропорційно до довжини делетованої ділянки. Ці спостереження доводять роль перших 22 амінокислот як інактиваційної “кульки”, а решти NH₂ кінцевого домену як “ланцюжка”, що сполучає кульку з каналом.

Прогноз про те, що, виходячи з моделі “кульки і ланцюжка” додавання ізольованих кульок до цитоплазматичного боку каналів, не здатних до інактивації відновить цю їхню здатність підтвердився експериментами Zagottaetal. В цих експериментах рівень відновленої каналами інактивації залежав від концентрації доданого кулькового пептиду. Ефект дії пептиду виявився зворотнім і не спостерігався при попередній обробці пептиду трипсином.

Shaker В інактиваційна кулька має первинну структуру, що містить 11 гідрофобних або незаряджених залишків та наступну групу з восьми сильно полярних аміноки