Полимеразная цепная реакция и электрофорез

Реферат на тему:

ПЦР-реакция и электрофорез

2009

ПЦР-реакция

Может возникнуть необходимость увеличить количество индивидуальной кДНК до ее введения в плазмиду с помощью какого-то процесса ее воспроизводства. Такой процесс разработан и широко применяется не только для решения этой частной задачи, но и во всех случаях, когда необходимо умножить количество определенных фрагментов ДНК. Например, фрагментов, содержащих изучаемый ген и его регуляторное окружение.

Процесс этот получил название ПЦР-реакция, что расшифровывается как полимеразная цепная реакция. (В английском названии PCR — polymerasechainreaction.) Невольно напрашивается сопоставление с реакцией атомного взрыва. И, пожалуй, оно не лишено смысла — нарастание количества нужной ДНК происходит чрезвычайно быстро, даже бурно.

Рассмотрим эту реакцию для общего случая — наработки множества копий некоего фрагмента ДНК, содержащего в какой-то своей части интересующую нас последовательность пар оснований. Итак, допустим, что нам известна последовательность нуклеотидов на достаточно большом протяжении некой ДНК и есть основания предполагать, что внутри этой последовательности лежит интересующий нас участок. Рассмотрим серию операций, ведущих к его выделению и умножению.

Сначала в местах, лежащих близко, но заведомо за пределами интересующего нас участка ДНК, выберем две последовательности — по 20 пар нуклеотидов, лежащих по обе стороны от этого участка. Исходя из этих последовательностей синтезируем химически два однонитевых праймера на основе дезоксирибонуклеотидов. Первый — комплементарно к условно «первой» нити ДНК с ее Законна, второй — комплементарно ко «второй» нити с ее Законна. Очевидно, что праймеры будут разные.

Теперь добавим в буфер, где растворено малое количество исходной ДНК оба праймера в большом избытке, нагреем смесь до температуры 94°, а потом быстро охладим до 50°. ДНК денатурируется при 94°, ее нити расходятся. При 50° оба праймера гиб-ридизируются с выбранными для них участками однонитевых ДНК. Это произойдет быстро, так как праймеры имеются в избытке и, кроме того, вследствие своей малости они подвижны и легко «найдут» свои посадочные места. Ренатурация ДНК происходит медленно. За те 2 минуты, что будет продолжаться этот этап, ДНК практически не ренатурируется, а праймеры успеют надежно гибридизоваться с комплементарными для них участками обеих нитей. Такая ситуация отражена на рисунке 35 (1). Праймеры, как обычно, садятся с 3"-конца матричной нити ДНК и направляют движение будущей ДНК-полимеразы к ее 5'-концу. Это направление указано стрелками. Для удобства описания дальнейших событий, присвоим праймерам названия «левый» (стрелка зачернена) и «правый» (стрелка не зачернена).

Теперь быстро поднимем температуру смеси до 72 °С. при этой температуре нити ДНК заведомо не сойдутся, а праймеры еще удержатся на своих местах. Внесем в раствор ДНК-полимеразу. Вообще-то говоря, она там была с самого начала!

Но что это за фермент, который не денатурируется при 94°, а при 72° сейчас начнет вести комплементарный синтез ДНК? К счастью, такая ДНК-полимераза существует. Ее называют «Taq ДНК-полимераза» и выделяют из очень термофильных бактерий «Thermusaquaticus», прекрасно размножающихся при температуре 85 °С.

Итак, переходим к этапу 2, где изображен процесс матричного синтеза комплементарной нити ДНК, начинающийся от праймера и продолжающийся без других ограничений (что отмечено стрелой), кроме ограничения длительности этого этапа (3 минуты). Мы будем для простоты рисунка рассматривать события, начинающиеся с копирования только одной нити, хотя, конечно, будут копироваться обе. Они совершенно равноправны, и в заключение нашего анализа надо будет просто удвоить полученный результат. Через 3 минуты оканчивается 2-й этап и температура снова скачком поднимается до 94°, а еще через одну минуту быстро снижается до 50°. Эта ситуация отражена на этапе 3. При 94° новосинтезированная нить ДНК отделилась от материнской нити. (Последнюю, для ясности, я здесь и всюду далее изображаю жирной линией.) В составе новосинтезированной копии я больше не изображаю «левый» праймер, поскольку он был комплементарен материнской нити ДНК и потому вместе с участком, синтезированным ДНК-полимеразой, вошел в состав копии. Зато на эту копию с ее 3'-конца при 50° на предназначенный для него участок (ведь копия тождественна «второй» материнской нити) уже сел «правый» праймер. На освободившуюся материнскую нить с ее З*-конца тоже сел праймер — «левый», но, конечно, не тот, что ушел с копией, а другой, точно такой же. Благо праймеры имеются в избытке.

На этапе 4 (при 72°) показаны два новых комплементарных синтеза. Тот, что идет по материнской нити, по-прежнему, пространственно не ограничен. А вот тот синтез, что начинается от правого праймера, сидящего на новосинтезированной копии окончится там, где в этой копии «спрятан» весь бывший «левый» праймер — ведь с него эта копия начиналась. В результате здесь впервые появляется выбранный для умножения участок ДНК, ограниченный двумя праймерами, включая и их самих. Это хорошо видно на этапе 5, когда после нагрева до 94° все двойные нити разошлись и на рисунке оказываются уже 4 одинарных нити, на которые, туда «где им положено» село 4 праймера (два «левых» и два «правых»). Этап 6 — синтез 4-х копий, начинающихся от этих праймеров. В трех случаях из четырех он ограничен длиной нужного отр