Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов

Реферат

по биологии

на тему:

"Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития"

2009

Введение

Сообщение о получении культуры ЭС клеток мыши было сделано одновременно в двух работах в 1981 г.. В настоящее время ЭС клетки подразделяют на три типа.

1. Клетки, изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты млекопитающих, именно эти клетки принято называть эмбриональными стволовыми клетками.

2. Клетки эмбриональных карцином.

3. Первичные половые клетки зародыша.

На рис. представлена общепринятая в настоящее время схема получения ЭС клеток и их использование для получения химерных животных. В последние годы ЭС клетки используются в различных направлениях исследований.

Кроме экспериментов по получению химерных животных и направленному изменению генов с целью изучения их функций в процессе развития и на уровне взрослого организма, ЭС клетки используются в экспериментах по клонированию животных и изучению начальных стадий эмбрионального развития invitro. Большой интерес в последние годы вызывает направление, связанное с изучением путей направленной дифференцировки ЭС и стволовых клеток млекопитающих и, что особенно важно человека, в определенные типы клеток invitro. Способность управлять этими процессами позволит в перспективе использовать такие клетки в заместительной терапии различных тяжелых заболеваний человека, таких как нейродегенеративные, онкологические и др.

ЭС клетки обладают высокой пролиферативной активностью и способностью в течение длительного времени в культуре поддерживаться в недифференцированном состоянии. Для сохранения недифференцированного фенотипа ЭС клеток в культуре требуется наличие фидерного слоя, который может быть представлен первичными эмбриональными фибробластами или перевиваемыми фибробластами мыши линии STO.

На рис. показан рост ЭС клеток на фидерном слое эмбриональных фибробластов мыши. Другой метод предупреждения дифференцировки ЭС клеток включает добавление в культуральную среду в отсутствие фидера LIF, который представляет собой гемопоэтический регулятор, индуцирующий дифференцировку клеток миелоидной лейкемии линии Ml. Успешно используются и ряд других цитокинов для сохранения недифференцированного состояния ЭС клеток: интерлейкин-6, онкостатин, цилиарный нейротрофический фактор. В качестве методических приемов предупреждения дифференцировки ЭС клеток используются: добавление в среду LIF в присутствии фидерного слоя, фидерные клетки, трансформированные рекомбинантным вектором и экспрессирующие LIF, и применение рекомбинантного LIF в отсутствие фидерного слоя.

Все описанные линии ЭС клеток мыши сходны по своим морфологическим характеристикам. Клетки имеют крупное ядро, содержащее преимущественно эухроматин и несколько ядрышек. Для них свойственно высокое ядерно-цитоплазматическое отношение: цитоплазма представлена узким ободком, окружающим ядро. Клеточный цикл 18—20 ч, П,-фаза очень короткая. Кариотипический анализ 35 линий ЭС клеток показал, что 25 из них имеют кариотип ХУ, а остальные ХО и XX. Авторы полагают, что ЭС клетки предпочтительней образуются из клеток с мужским кариотипом, поскольку вторая Х-хромосома может явиться дестабилизатором плюрипотентности. В основном все ЭС клетки имеют нормальный кариотип 2п = 40, изменения в кариотипе могут приводить к потере плюрипотентности.

Схема получения ЭС клеток и их использование при изучении процессов направленной дифференцировки в системах invitroи invivo, а также при создании трансгенных животных

Особенностью ЭС клеток является высокая активность эндогенной щелочной фосфатазы. Методом количественного анализа было установлено, что активность эндогенной щелочной фосфатазы стволовых клеток тератокарцином, внутренней клеточной массы бластоцисты, эпибласта 5-6-дневного эмбриона, первичных половых клеток в 10 раз превышает таковую у дифференцированных соматических клеток. Для ЭС клеток характерен также высокий уровень теломеразной активности, который коррелирует со степенью недифференцированности ЭС клеток. Сохранение недифферен цированного фенотипа ЭС клеток в культуре может быть подтверждено использованием антител к специфическим поверхностным антигенам ЭС, таких как ЕСМА-7, SSEA-1.

Основные направления исследований, в которых в настоящее время используются эмбриональные стволовые клетки млекопитающих

При определенных условиях культивирования ЭС клетки формируют эмбриоидные тела, которые представляют собой зачатки эндодермы, эктодермы и мезодермы, напоминая постимплантационное эмбриональное развитие. Если эмбриоидные тела прикрепляются к субстрату, то клетки, формирующие внутренние слои таких тел, способны в дальнейшем дифференцироваться в широкий спектор тканей, такие как мышечная, нервная, эпителиальная и др. Способность ЭС клеток к дифференцировке invitroиспользуется как модель для исследования процессов клеточной дифференцировки в разные типы тканей.

После инъекции ЭС клеток в бластоцисты они способны участвовать в образовании всех тканей, включая и линии зародышевых клеток химерного организма. Способность ЭС клеток дифференцироваться invivoоценивается по частоте химер и степени колонизации тканей химерного потомства, а также по частоте генеративных химер. Это свойство клеток в сочетании с методом гомологичной рекомбинации, которая позволяет направленно изменять геном ЭС клеток, дает возм