культивирования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta : взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков
Особое положение тяжелых металлов (ТМ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воздействие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах - микроводорослях и цианобактериях, которые наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).
Ванадий, как один из широко распространенных ТМ, используется зелеными, желто-зелеными и бурыми водорослями, содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, но не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных микроорганизмов, среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseudomonas , а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический эффект обусловлен главным образом тем, что восстанавливаясь в клетках, он стимулирует образование свободнорадикальных состояний О2 (Popper et al., 1991).
Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-группами тиоловых соединений клеток: реакция обратима, но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчинский, 1977). Устойчивость фототрофных и других микроорганизмов к действию ТМ в наибольшей степени обусловлена специфическим связыванием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле специализированных белков - металлотионеинов (МТ). Общим для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп. В спектре оптического поглощения МТ в УФ-области около 250 нм, наблюдаются типичные для металлтиолатных комплексов шиpокие полосы, которые исчезают пpи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии, культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют связывающий ионы металла МТ второго класса (Саванина и др., 1995).
В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных, богатых SH-группами белков и изменениями окислительно-восстановительного потенциала (Eh ) среды.
В работе использовали гетеротрофные бактерии, выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др., 1998). Бактерии культивировали при температуре 25-27° в конических колбах на среде, содержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г/л (pH 7,2).
Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с использованием мембраны фирмы Serva (Германия) с диаметром пор, пропускающих молекулы массой <10-15 кД. В присутствии ЭДТА, сульфгидрильные группы МТ и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными.
Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Для определения концентрации ванадия в биологическом материале и культуральной жидкости использовали цветную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо)-резорцином. Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной кислотой. Оптическую плотность измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм используя коэффициент молярной экстинкции 24500 М-1 см-1 . Содержание диализованных низкомолекулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию тиоловых групп в этих белках и других соединениях определяли с реактивом Элмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400 М-1 см-1 . Величины pH и Eh среды култивирования измеряли на электрометре фирмы Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия); для определения Eh использовали Pt-электрод, а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба электрода Российского производства); потенциал электрода сравнения относительно нормального водородного электрода, измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225±10 мВ. Таким образом, истинная величина Eh среды представляет собой сумму измеряемой величины Eh и потенциала электрода сравнения.
Рис. 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta ; 1 - контроль; 2, 3 - в присутствии 100 и 700 мг/л ванадата соответственно.
Клетки Ps. diminuta , изолированные из пробы придонного ос
Одними из наиболее популярных услуг на рынке IT-технологий являются создание и продвижение лендингов. Они способны положительно влиять на деятельность любого бизнес-проекта в интернете. Судя по многочисленным отзывам, заказавшие создание лендингов люди ни разу не пожалели о потраченных деньгах. Они вложили в будущее, которое неразрывно связано с интернетом. Всё больше и больше предпринимателей обращаются к услугам разных агентств, веб-студий, чтобы заказать создание лендинга у профессионалов.