Потенциометрический и амперометрический иммуноанализ

Потенциометрический и амперометрический иммуноанализ

Введение

Меченные ферментом антитела стали получать с середины шестидесятых годов. Сначала их использовали для визуального обнаружения антигенов в гистологии и линий преципитации в иммуноэлектрофорезе. Количественное определение иммунореагентов с помощью ферментной метки стало возможным после разработки способов иммобилизации антигенов на твердой подложке. Этим работам предшествовало внедрение в иммуноанализ в качестве меток радиоактивных изотопов, и в то, время ферменты казались менее перспективными метками. Радиоиммуноанализ широко применялся в клинических анализах благодаря хорошей чувствительности и достаточной селективности. В настоящее время все чаще стали обсуждать недостатки РИА, связанные, например, с коротким периодом полураспада йода-125 и проблемами захоронения радиоактивных отходов. Однако простота измерения радиоактивной метки при удовлетворительных чувствительности и точности первоначально обеспечивала методу РИА некоторые преимущества перед методом иммуноферментного анализа. Примерно в то же время впервые было описано применение электродов для определения биологических молекул. Первые электроды создавались исключительно на основе ферментов в силу их высокой специфичности к субстратам. Были разработаны ферментные электроды для определения многих компонентов биологических жидкостей, например глюкозы и мочевины. К сожалению, ферменты не обязательно абсолютно специфичны по отношению только к одному субстрату, и поэтому всегда есть вероятность мешающего влияния со стороны других биологических компонентов проб. Несмотря на недостаточную специфичность, ферментные электроды, как и другие электрохимические детекторы, имеют и ряд положительных качеств, в первую очередь относительно низкую стоимость и простоту в эксплуатации. Кроме того, для них характерен низкий предел обнаружения, в ряде случаев приближающийся к пределу обнаружения с помощью РИА.

Электрохимические методы иммуноанализа создавались с целью объединения чувствительности электрохимического детектора и специфичности, присущей реакции взаимодействия антиген-антитело. Существуют два типа электрохимических сенсоров:

амперометрические, в которых потенциал электрода инициирует реакцию й измеряется сила тока;

потенциометрические, в которых на границе раздела сенсор-раствор устанавливается локальное равновесие и измеряется мембранный или электродный потенциал.

В потенциометрическом иммуноанализе доминируют три направления: прямое определение степени связывания белков;

использование ионо- и газоселективных электродов для определения продуктов иммунохимической реакции с ферментной меткой;

включение ионофоров в мембраны ионоселективных электродов.

В большинстве ранних публикаций по протенциометрическим ферментным детекторам описаны связанные с мембраной антигены и их применение для определения специфических антител. Присоединением ионофора к антигену можно достичь усиления выходного сигнала. В более поздних публикациях описаны сенсоры и для определения антигенов, на мембране которых в свою очередь иммобилизованы антитела.

Амперометрические иммуноанализы подразделяют на два основных типа:

1) анализы с использованием ферментных меток, которые катализируют образование электрохимически активного продукта;

2) анализы, в которых сама метка электроактивна или придает электроактивность другим веществам, например путем присоединения нитрогрупп.

Иногда выделяют также вольтамперрметрический иммуноанализ с металлоценовыми метками. Амперометрию можно применять как в гомогенном, так и в гетерогенном иммуноанализе. В гомогенных системах нет необходимости в операции отделения свободного антигена от связанного; основой гомогенного иммуноанализа является изменение электрохимической активности или какого-либо другого свойства метки при связывании меченого антигена с антителами, приводящее к изменению интенсивности сигнала. Соответствующие методики очень просты, однако им свойственны и некоторые недостатки. Так, на реакцию связывания может влиять матрикс, что приводит к повышению фонового сигнала. Гетерогенный иммуноанализ, включающий операцию разделения, обладает большей чувствительностью; в этом случае предел обнаружения может приближаться к пределу обнаружения РИА. Операция разделения уменьшает ошибки, обусловленные влиянием компонентов пробы на электрохимическую реакцию, и предохраняет электрод от загрязнения. Опубликован обзор, посвященный стратегии электрохимического иммуноанализа.

Потенциометрический иммуноанализ

Прямое определение связывания антигенов или антител. Прямое определение степени связывания антигенов представляется вполне целесообразным, поскольку при этом отпадает необходимость во введении метки. В водном растворе белки являются полиэлектролитами и поэтому имеют определенный результирующий электрический заряд. Полярность и величина этого заряда зависят от изоэлектрической точки белка и от ионного состава раствора. Связывание одного белка с другим приведет к образованию комплекса, результирующий заряд которого будет отличаться от зарядов исходных белков. Этот принцип впервые был применен Джанатой на примере конканавалина А, иммобилизованного на покрытой поливинил хлоридом проволоке. Такой электрод позволял определять в растворе дрожжевого маннана в диапазоне концентраций 0,1-1,0 мг/мл, однако аналогичный эффект в системе овальбумин - антитела к овальбумину обнаруж